Atividade Antioxidante
Antioxidantes são substâncias que retardam as reações de degradação oxidativa, ou seja, reduzem a velocidade da oxidação por um ou mais mecanismos, como inibição de radicais livres e complexação de metais. As substâncias antioxidantes podem apresentar diferentes propriedades protetivas e agir em diversas etapas do processo oxidativo, funcionando por diferentes mecanismos e são, portanto, classificadas em duas categorias principais: antioxidantes primários e secundários.
São considerados primários os compostos de ação antioxidante capazes de inibir ou retardar a oxidação por inativação de radicais livres graças à doação de átomos de hidrogênio ou de elétrons, o que transforma os radicais em substâncias estáveis. Os antioxidantes secundários apresentam uma grande variedade de modos de ação: ligação de íons metálicos (alteração de valência); conversão de hidroperóxidos em espécies não-radicais ou absorção de radiação ultravioleta (UV).
Em muitos estudos tem-se demonstrado que compostos com propriedades antioxidantes são antitumorais e têm sido amplamente usados tanto na prevenção quanto no tratamento de diversas doenças.
Como exemplo, é possível verificar a avaliação da atividade antioxidante por meio espectrofotométrico baseado na descoloração ou oxidação do β-caroteno induzida pelos produtos de degradação oxidativa de um ácido graxo, como o ácido linoleico.
Método do Sequestro do radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH)
A molécula de DPPH é caracterizada como um radical livre estável em virtude da deslocalização do elétron desemparelhado por toda a molécula. Tal deslocalização confere a esta molécula uma coloração púrpura, caracterizada por uma banda de absorção em etanol em cerca de 518 nm.
Este ensaio se baseia na medida da capacidade antioxidante de uma determinada substância em sequestrar o radical DPPH (Figura 1), reduzindo-o a hidrazina. Quando uma determinada substância que age como doador de átomos de hidrogênio é adicionada a uma solução de DPPH, a hidrazina é obtida com mudança simultânea na coloração de púrpura a amarelo pálido (ALVES et al., 2010), tal reação pode ser monitorada com decréscimo de absorbância em espectrofotômetro.
São considerados primários os compostos de ação antioxidante capazes de inibir ou retardar a oxidação por inativação de radicais livres graças à doação de átomos de hidrogênio ou de elétrons, o que transforma os radicais em substâncias estáveis. Os antioxidantes secundários apresentam uma grande variedade de modos de ação: ligação de íons metálicos (alteração de valência); conversão de hidroperóxidos em espécies não-radicais ou absorção de radiação ultravioleta (UV).
Em muitos estudos tem-se demonstrado que compostos com propriedades antioxidantes são antitumorais e têm sido amplamente usados tanto na prevenção quanto no tratamento de diversas doenças.
Como exemplo, é possível verificar a avaliação da atividade antioxidante por meio espectrofotométrico baseado na descoloração ou oxidação do β-caroteno induzida pelos produtos de degradação oxidativa de um ácido graxo, como o ácido linoleico.
Método do Sequestro do radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH)
A molécula de DPPH é caracterizada como um radical livre estável em virtude da deslocalização do elétron desemparelhado por toda a molécula. Tal deslocalização confere a esta molécula uma coloração púrpura, caracterizada por uma banda de absorção em etanol em cerca de 518 nm.
Este ensaio se baseia na medida da capacidade antioxidante de uma determinada substância em sequestrar o radical DPPH (Figura 1), reduzindo-o a hidrazina. Quando uma determinada substância que age como doador de átomos de hidrogênio é adicionada a uma solução de DPPH, a hidrazina é obtida com mudança simultânea na coloração de púrpura a amarelo pálido (ALVES et al., 2010), tal reação pode ser monitorada com decréscimo de absorbância em espectrofotômetro.
Figura 1. Molécula de DPPH na forma radicalar (A) e na forma reduzida (B).
O método de DPPH é muito utilizado para se determinar a atividade antioxidante em extratos e substâncias isoladas como: compostos fenólicos, fenilpropanoides, fenólicos totais, flavonóis, cumarinas, quitosana com diferentes pesos moleculares, antocianinas, antocianidinas, carotenoides, rutina e kaempferol.
A atividade antioxidante dos compostos é expressa em porcentagem de redução do DPPH. Para cada amostra o ensaio deve ser realizado em triplicata e os resultados devem ser apresentados em Concentração Efetiva 50% (EC50). A concentração efetiva 50%, expressa a concentração mínima de antioxidante necessária para reduzir em 50% a concentração inicial de DPPH.
A atividade antioxidante dos compostos é expressa em porcentagem de redução do DPPH. Para cada amostra o ensaio deve ser realizado em triplicata e os resultados devem ser apresentados em Concentração Efetiva 50% (EC50). A concentração efetiva 50%, expressa a concentração mínima de antioxidante necessária para reduzir em 50% a concentração inicial de DPPH.
Fonte: Neplame.
Método da co-oxidação do β-caroteno/ácido linoleico
O β-caroteno é o mais abundante dos carotenoides e largamente utilizado em terapias. É quase completamente insolúvel em água, mas facilmente solúvel em ambientes lipofílicos e solventes pouco polares. Este método permite avaliar a capacidade de uma determinada substância prevenir a oxidação do β-caroteno, protegendo-o dos radicais livres gerados durante a peroxidação do ácido linoleico. Nesse método, o ácido linoleico libera um radical livre que reage com o β-caroteno, levando-o a perder o seu cromóforo e sua coloração laranja original, com diminuição da absorbância (Figura 3). Substâncias antioxidantes impedem essa reação por reagirem com o radical livre.
A reação pode ser monitorada espectrofotometricamente pela perda da coloração do β-caroteno em 470 nm, com leitura imediata e em intervalos de 15 min, por um tempo total de 2 h.
O β-caroteno é o mais abundante dos carotenoides e largamente utilizado em terapias. É quase completamente insolúvel em água, mas facilmente solúvel em ambientes lipofílicos e solventes pouco polares. Este método permite avaliar a capacidade de uma determinada substância prevenir a oxidação do β-caroteno, protegendo-o dos radicais livres gerados durante a peroxidação do ácido linoleico. Nesse método, o ácido linoleico libera um radical livre que reage com o β-caroteno, levando-o a perder o seu cromóforo e sua coloração laranja original, com diminuição da absorbância (Figura 3). Substâncias antioxidantes impedem essa reação por reagirem com o radical livre.
A reação pode ser monitorada espectrofotometricamente pela perda da coloração do β-caroteno em 470 nm, com leitura imediata e em intervalos de 15 min, por um tempo total de 2 h.
Figura 3. Estrutura do β-caroteno (A) e do ácido linoleico (B). Ao lado reação de oxidação do β-caroteno/ácido linoleico.
Sequestro do radical ABTS•+ (Ácido 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico)).
O método de sequestro do radical ABTS•+ consiste em um método generalista das classes de antioxidantes, sendo capturado tanto por antioxidantes de caráter hidrofílico quanto lipofílico (RUFINO et al., 2007). A estabilização do radical ABTS ocorre através da reação de oxidação entre o sal de persulfato de potássio (K2SO5) com a solução aquosa de 2,2’-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico). Dessa forma, a atividade antioxidante dos extratos e fases são analisados mediante o descoramento da solução do radical ABTS•+, monitoradas por espectrometria em comprimento de onda de 734 nm, conforme demonstrado na figura 4 (RUFINO et al., 2007).
Figura 4. Estabilização do radical ABTS por um antioxidante e sua formação pelo persulfato de potássio.
Fonte: adaptado de Comunicado Técnico online 128, Embrapa-CE.
Análise por fluorescência - ensaio fluorimétrico
A Espectroscopia por fluorescência é uma das técnicas que combina alta sensibilidade sem perda de especificidade ou precisão. Mais recentemente, o uso de quimio e bioluminescência tem aberto novos caminhos na pesquisa e aplicação, primeiramente no campo de imunoensaios. Por apresentar uma série de vantagens, a espectroscopia por fluorescência tem sido largamente utilizada na busca por antioxidantes de fontes naturais, originando assim uma série de métodos que podem auxiliar na seleção e avaliação de substâncias bioativas.
Sequestro do radical peroxil - Método ORAC
Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) é um método que se baseia na propriedade fluorescente das proteínas B-ficoeritrina (B-PE) e R-ficoeritrina (R-PE). Estas proteínas são usadas como indicador fluorescente. Neste ensaio o radical peroxil, gerado pela reação do AAPH [dicloreto de 2,2'-azobis(2-amidinopropano)] com oxigênio atmosférico, reage com o indicador fluorescente para formar um produto não fluorescente, que pode ser medido por espectrofotometria com máxima emissão de fluorescência em 575 nm (B-PE) e 578 nm (R-PE).
Tal ensaio avalia a atividade antioxidante através da inibição da oxidação, induzida pelo radical peroxil, por transferência de átomos de hidrogênio. A atividade antioxidante de uma dada substância é determinada através da diferença entre a área da amostra subtraída pela área do branco (AUC), medida pelo decaimento da fluorescência com a adição da substância antioxidante no decorrer do tempo.
Usando-se Trolox de concentrações conhecidas, uma curva padrão é gerada e a atividade ORAC da amostra é calculada. Este ensaio expressa o resultado em unidade de ORAC ou equivalentes de Trolox, o qual corresponde à quantidade de Trolox em micromols que tem a mesma atividade antioxidante de um litro da solução testada.
Sequestro de radical superóxido - Xantina oxidase
Xantina oxidase (XO) é a enzima responsável pela transformação tanto da hipoxantina em xantina, quanto desta em ácido úrico, tendo como consequência a produção de peróxido de hidrogênio e radical superóxido (Figura 5), por isso é considerada uma das principais fontes biológicas de espécies reativas de oxigênio. Assim, é possível que a inibição deste processo enzimático por compostos que exibem propriedades antioxidante ou inibitória da xantina oxidase possam ter uso terapêutico.
Figura 5. Conversão da hipoxantina a xantina e desta a ácido úrico.
O ensaio antioxidante quelante de metais é um método simples para avaliar o potencial de uma amostra de reduzir a peroxidação lipídica ou a formação de radicais livres, produtos das reações de Fenton e de Haber-Weiss (Figura 6A). Esse método é baseado na utilização do reagente ferrozina que, na presença do íon Fe2+, forma um complexo de cor rósea, cuja absorbância pode ser medida no comprimento de onda de 562 nm.
O potencial antioxidante é monitorado pela diminuição da absorbância, visível pela descoloração da reação. O método determina a quantidade remanescente de íons ferro não quelados na mistura de reação (Min et al., 2011). Dessa forma, quanto menor a absorbância, ou menor intensidade da coloração rosa (Figura 6B), maior será o potencial antioxidante e, portanto, maior a capacidade de quelar os íons ferro.
O potencial antioxidante é monitorado pela diminuição da absorbância, visível pela descoloração da reação. O método determina a quantidade remanescente de íons ferro não quelados na mistura de reação (Min et al., 2011). Dessa forma, quanto menor a absorbância, ou menor intensidade da coloração rosa (Figura 6B), maior será o potencial antioxidante e, portanto, maior a capacidade de quelar os íons ferro.
Figura 6. (A) Reação de Fenton e Haber- Weiss; (B) Reação da curva padrão para ácido gálico (0 - 12 µg.mL-1).
Quantificação do teor de fenóis
Método de Folin-Ciocalteau
O teor de compostos fenólicos pode ser determinado através do teste que utiliza o reagente de Folin-Ciocalteau (SLINKARD; SINGLETON, 1977), que consiste na mistura dos ácidos fosfomolíbdico e fosfotunguístico, na qual o molibdênio e o tungstênio se encontram no estado de oxidação 6+ (cor amarela no complexo Na2MoO4.2H2O) na presença de agentes redutores, como os compostos fenólicos, formam-se os complexos molibdênio-tungstênio azuis [(PMoW11O4)4-], em que a média do estado de oxidação dos metais está entre 5+ e 6+ e cuja coloração permite a determinação da concentração das substâncias redutoras que, não necessariamente, precisam ter natureza fenólica.
A mudança de coloração permite quantificar o teor de compostos fenólicos em uma amostra por espectrofotometria, empregando um ácido fenólico como padrão (ácido gálico). Este padrão fenólico, sofre desprotonação em meio básico, gerando o ânion fenolato (Figura 7). Em seguida, ocorre uma reação de oxirredução entre o ânion fenolato e o reagente de Folin-Ciocalteau, dessa forma, o molibdênio, componente do reagente, sofre redução e o meio reacional muda a coloração de amarelo para azul (ARAÚJO, 2013).
Método de Folin-Ciocalteau
O teor de compostos fenólicos pode ser determinado através do teste que utiliza o reagente de Folin-Ciocalteau (SLINKARD; SINGLETON, 1977), que consiste na mistura dos ácidos fosfomolíbdico e fosfotunguístico, na qual o molibdênio e o tungstênio se encontram no estado de oxidação 6+ (cor amarela no complexo Na2MoO4.2H2O) na presença de agentes redutores, como os compostos fenólicos, formam-se os complexos molibdênio-tungstênio azuis [(PMoW11O4)4-], em que a média do estado de oxidação dos metais está entre 5+ e 6+ e cuja coloração permite a determinação da concentração das substâncias redutoras que, não necessariamente, precisam ter natureza fenólica.
A mudança de coloração permite quantificar o teor de compostos fenólicos em uma amostra por espectrofotometria, empregando um ácido fenólico como padrão (ácido gálico). Este padrão fenólico, sofre desprotonação em meio básico, gerando o ânion fenolato (Figura 7). Em seguida, ocorre uma reação de oxirredução entre o ânion fenolato e o reagente de Folin-Ciocalteau, dessa forma, o molibdênio, componente do reagente, sofre redução e o meio reacional muda a coloração de amarelo para azul (ARAÚJO, 2013).
Figura 7. Reação de redução do molibdênio, componente do reagente de Folin-Ciocalteau, pelo ácido gálico, padrão utilizado na determinação de fenóis totais.
Quantificação do teor de flavonoides
A quantificação do teor de flavonoides pode ser determinada através da reação com o cloreto de alumínio, este reagente exibe seletividade com os flavonoides, diferenciando-os dos demais compostos fenólicos, em razão do seu poder de formação de complexos estáveis entre o cátion Al3+ e as hidroxilas livres presentes nas moléculas dos flavonoides.
Um complexo de coloração vermelha é formado a partir da reação de complexação da catequina com Al3+, conforme ilustrado na figura 8. Com isso, a intensidade da coloração é proporcional à quantidade de complexo formada e, de flavonoides presentes na amostra. Para esse teste, o flavonoide catequina é utilizado como padrão.
Figura 8. Reação de complexação da catequina com Al3+ durante o teste de quantificação de flavonoides totais.
Referência
ALVES, C. Q.; DAVID, J. M.; DAVID, J. P.; BAHIA, M. V.; AGUIAR, R. M. Métodos para determinação de atividade antioxidante in vitro em substratos orgânicos. Química Nova, v. 33, n. 10, 2010.
HARB, T. B.; TORRES, P. B.; PIRES, J. S.; SANTOS, D. Y. A. C.; CHOW, F. Ensaio de microplaca do potencial antioxidante através do sistema quelante de metais para extratos de algas. Instituto de Biociências, s.v, p. 1-5, 2016.
KRISHNAIAH, D., SARBATLY, R., NITHYANANDAM, R. A review of the antioxidant potential of medicinal plant species. Food and Bioproducts Processing, 89, 217–233, 2011.
MIN, B.; MCCLUNG, A. M.; CHEN, MH. Phytochemicals and antioxidant capacities in rice brans of different color. Journal of Food Science. v. 76, p.117-126, 2011.
OLIVEIRA, A. C.; VALENTIN, I. B.; GOULART, M. O. F.; SILVA, C. A.; BACHARA, E. J. H.; TREVISAN, M. T. S. Fontes vegetais de antioxidantes. Química Nova. v. 32, n. 3, p. 689-702, 2009
PEIXOTO-SOBRINHO, T. J. S. et al. Teor de flavonóides totais em produtos contendo pata-de-vaca (Bauhinia L.) comercializados em farmácias de Recife/PE. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 14, p. 586-591, 2012.
RUFINO, M. S. M. ALVES, R. E.; BRITO, E. S.; MORAIS, S. M.; SAMPAIO, C.G.; PÉEZ-JIMN, J.; SAURA-CALIXTO, F. D.. Metodologia científica: Determinação da atividade antioxidante total em frutas pela captura do radical livre ABTS•+. Comunicado técnico online, v.128, 2007.
SLINKARD, K.; SINGLETON, V. L. Total phenol analyses automation and comparison with manual methods. American Journal of Enology and Viticulture, v. 28, p. 49-55, 1977.
ALVES, C. Q.; DAVID, J. M.; DAVID, J. P.; BAHIA, M. V.; AGUIAR, R. M. Métodos para determinação de atividade antioxidante in vitro em substratos orgânicos. Química Nova, v. 33, n. 10, 2010.
HARB, T. B.; TORRES, P. B.; PIRES, J. S.; SANTOS, D. Y. A. C.; CHOW, F. Ensaio de microplaca do potencial antioxidante através do sistema quelante de metais para extratos de algas. Instituto de Biociências, s.v, p. 1-5, 2016.
KRISHNAIAH, D., SARBATLY, R., NITHYANANDAM, R. A review of the antioxidant potential of medicinal plant species. Food and Bioproducts Processing, 89, 217–233, 2011.
MIN, B.; MCCLUNG, A. M.; CHEN, MH. Phytochemicals and antioxidant capacities in rice brans of different color. Journal of Food Science. v. 76, p.117-126, 2011.
OLIVEIRA, A. C.; VALENTIN, I. B.; GOULART, M. O. F.; SILVA, C. A.; BACHARA, E. J. H.; TREVISAN, M. T. S. Fontes vegetais de antioxidantes. Química Nova. v. 32, n. 3, p. 689-702, 2009
PEIXOTO-SOBRINHO, T. J. S. et al. Teor de flavonóides totais em produtos contendo pata-de-vaca (Bauhinia L.) comercializados em farmácias de Recife/PE. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 14, p. 586-591, 2012.
RUFINO, M. S. M. ALVES, R. E.; BRITO, E. S.; MORAIS, S. M.; SAMPAIO, C.G.; PÉEZ-JIMN, J.; SAURA-CALIXTO, F. D.. Metodologia científica: Determinação da atividade antioxidante total em frutas pela captura do radical livre ABTS•+. Comunicado técnico online, v.128, 2007.
SLINKARD, K.; SINGLETON, V. L. Total phenol analyses automation and comparison with manual methods. American Journal of Enology and Viticulture, v. 28, p. 49-55, 1977.
