Atividade Antinociceptiva
O interesse em investigar plantas com atividade analgésica reside no fato de que as mesmas têm uma vasta aplicação em vários processos patológicos. Devido à baixa eficácia e expressivos efeitos adversos apresentados pela maioria dos fármacos disponíveis no mercado farmacêutico para este fim, surge o grande interesse dos pesquisadores na descoberta de novos protótipos de fármacos provenientes de plantas da flora brasileira. Vários modelos in vivo são utilizados na pesquisa de compostos com atividade analgésica. Várias das técnicas descritas, utilizadas para um screening da atividade antinociceptiva são gerais e independem do composto a ser ensaiado.
Apesar de, na maioria das vezes, não se chegar ao mecanismo de ação definitivo da substância ou extrato da planta em estudo, esses modelos experimentais são de grande importância e representam o ponto de partida para a caracterização farmacológica de novos compostos capazes de interferir com o curso da dor.
Muitos dos experimentos realizados com metodologias que empregam estímulos dolorosos são realizados em animais, os quais apresentam reações comportamentais compatíveis com a sensação de dor, porém, uma vez que não é possível determinar objetivamente se a sensação apresentada é realmente dor (já que o animal não pode se comunicar), é preferível classificá-la como sendo resultado da ativação das vias nociceptivas. Portanto, é possível denominar tais reações em animais experimentais como nocicepção.
Diversos são os testes possivelmente aplicados em laboratório, tais como os que avaliam a ação de drogas sobre comportamentos indicativos de nocicepção manifesta, nos quais o estímulo utilizado causa, por si só, a ativação das vias nociceptivas, induzindo o comportamento compatível com dor (como nos casos do teste da formalina ou de contorções abdominais com ácido acético).
Ainda existem testes nos quais são avaliados parâmetros que indiquem a presença de fenômenos como a hipernocicepção ou alodinia, ou seja, nos quais ocorre diminuição do limiar de tolerância à estimulação de caráter mecânico, térmico ou químico.
Teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético
O teste das contorções abdominais é um modelo químico de nocicepção que se baseia na contagem das contorções da parede abdominal seguidas de torção do tronco e extensão dos membros posteriores, como resposta reflexa à irritação peritoneal e à peritonite produzidas pela injeção intraperitoneal de uma solução de ácido acético 0,9%. Este teste é sensível à avaliação de drogas analgésicas, no entanto, pode ser visto como um modelo geral, não seletivo, para estudos de drogas antinociceptivas.
Teste da formalina
O teste da formalina é um método de avaliação comportamental utilizado para medir a efetividade de agentes antinociceptivos. Este modelo de dor está associado à lesão tecidual, no qual se quantifica a resposta comportamental provocada pela injeção subcutânea de formalina diluída na pata traseira do animal.
A vantagem deste teste sobre outros métodos de nocicepção é a possibilidade de avaliar dois tipos diferentes de dor ao longo de um período prolongado de tempo e, assim, permite o teste de analgésicos com diferentes mecanismos de ação.
As respostas comportamentais à formalina seguem um padrão bifásico composto de uma fase inicial aguda (primeira fase), e por um período mais prolongado (segunda fase) de atividade comportamental aumentada, que pode durar até cerca de uma hora. O período entre as fases é denominado intervalo de quiescência. A primeira fase inicia-se imediatamente após a injeção de formalina e se estende pelos primeiros 5 minutos (dor neurogênica ou aguda), estando relacionada com a estimulação química direta dos nociceptores das fibras aferentes do tipo C e, em parte, das fibras do tipo Aδ e está associada à liberação de aminoácidos excitatórios, óxido nítrico e substância P. A segunda fase ocorre entre 15 e 30 minutos após a injeção de formalina e está relacionada com a liberação de vários mediadores pró-inflamatórios, como bradicinina, prostaglandinas e serotonina, entre outros.
Teste da placa quente
O teste da placa quente (hot plate) avalia o tempo em que os animais permanecem sobre uma chapa metálica aquecida (55 ± 0,5 ºC) até reagirem ao estímulo térmico com o comportamento de levantar ou lamber as patas. As aferições são realizadas nos tempos de 30, 60, 90 e 120 minutos após a administração das substâncias a serem analisadas.
O modelo experimental foi inicialmente descrito como modelo específico para a detecção de sustâncias analgésicas de efeito central. Embora o uso de analgésico central e periférico responda pela inibição do número de contrações provocadas por estímulos químicos que levam à dor, apenas os analgésicos centrais aumentam o tempo de resposta no teste da placa quente. Este modelo utiliza a temperatura como estímulo nociceptivo.
Teste de retirada da cauda
O teste de retirada da cauda (tail-flick) é sensível para identificar a atividade de compostos presentes em extratos vegetais ou isolados a partir desses, além de sintéticos, cujos mecanismos sejam semelhantes aos promovidos pelos analgésicos opioides.
Este ensaio experimental consiste na aplicação de uma fonte radiante de calor na cauda do animal como estimulo nociceptivo térmico, provocando seu movimento de retirada. Um aumento no tempo de reação é geralmente considerado como um parâmetro importante para avaliar a atividade antinociceptiva central, caracterizando-se por uma nocicepção aguda não-inflamatória. Sendo assim, substâncias que atuam em nível central, como a morfina, são capazes de suprimir respostas de neurônios espinhais ao estímulo térmico nocivo na cauda, aumentando o tempo de latência.
Teste de Von Frey
A presença e extensão de comportamentos aversivos nas respostas a estímulos mecânicos são geralmente determinadas usando o teste de Von Frey. Os modelos experimentais baseados em testes mecânicos permitem a avaliação do aumento da sensibilidade do nociceptor a estímulos inócuos (alodinia) ou nocivos (hiperalgesia). Porém, além de estímulo de nociceptores de fibras Aδ e nociceptores de fibras C, também podem ser ativados mecanorreceptores, resultando em estímulos inespecíficos que nem sempre refletem a neurofisiologia da nocicepção. Particularmente, o teste de von Frey, é usado para avaliar através do estímulo mecânico inócuo e crescente (alodinia mecânica) a sensibilidade tecidual provocada pela incisão.
Os experimentos são realizados com um anestesiômetro eletrônico, que consiste em um transdutor de pressão adaptado a um contador digital de força expressa em gramas (g). O contato do transdutor de pressão com a pata é realizado através de uma ponta descartável de polipropileno. Os animais são colocados em caixas de acrílico durante 15-30 minutos, até que os comportamentos exploratórios tenham cessado. O assoalho da caixa é feito de arame não maleável na forma de rede. As alterações nos limiares nociceptivos são avaliadas exercendo-se uma pressão uniformemente crescente no centro da pata do animal até que uma resposta de retirada da pata seja desencadeada. A força em que essa resposta ocorre é registrada automaticamente pelo aparelho e é designada como o limiar de retirada da pata.
Teste de Randall-Selitto
O teste de Randall-Selitto é um método baseado na indução de hiperalgesia por meio da aplicação de uma pressão mecânica uniformemente crescente na pata do animal. Este teste é baseado no princípio de que a inflamação diminui o limiar de reação à dor e que essa redução pode ser modificada por analgésicos narcóticos e não-narcóticos.
Neste ensaio experimental, um agente flogístico é injetado no tecido subplantar de uma das patas traseiras, e é medido o tempo de latência da retirada da pata a partir da pressão exercida. O reflexo de retirada da pata é considerado representativo do limiar hipernociceptivo, ou seja, a força necessária aplicada à pata para que induza uma resposta aversiva a um estímulo nocivo (Limiar Nociceptivo de Retirada da Pata - LNRP). A força necessária para que esse animal exiba tal resposta é registrada em gramas. O LNRP é avaliado antes e após a administração dos estímulos hiperalgésicos ou inflamatórios, que variam de acordo com o experimento.